2019年10月（yuè）1日，5-羟甲（jiǎ）基（jī）化（huà）胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖尿病研究领域取得（dé）重要进展。2型糖尿病（T2D）的（de）血管并发症是导（dǎo）致（zhì）2型（xíng）糖尿（niào）病（bìng）致残致死的重要病因（yīn），一直缺乏一种无创便（biàn）捷的（de）临床途（tú）径（jìng）实现血管并发症的（de）发生发展监测，达（dá）到早（zǎo）发现（xiàn）、早（zǎo）干预，以提高T2D病人（rén）的整体生（shēng）活（huó）质量，减少卫（wèi）生经（jīng）济负担（dān）。

该研究入组（zǔ）了62例2型糖（táng）尿病（bìng）病人，采（cǎi）用（yòng）5hmC-Seal技术对血浆cfDNA中表（biǎo）观遗传标志物5hmC的（de）分布情况进行检测，分析5hmC标志物与2型糖尿病血管并发症发（fā）生发展的（de）相关性。结果表明5hmC标志物的变化与T2D合并大血管/微血管事件具（jù）有（yǒu）相关性，主要涉及一些与血管（guǎn）生物学和（hé）糖尿（niào）病（包括胰岛素耐受和炎症反（fǎn）应）相关的基（jī）因和（hé）信号通路。该研究建（jiàn）立的（de）16个基因-5hmC标志（zhì）物（wù）组（zǔ）合检测可以准确（què）区分有并发症（zhèng）和无并发（fā）症的2型糖（táng）尿病病人[实验组（zǔ）：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优于传统临（lín）床变量例如白蛋白尿（niào）。除此之外，还（hái）建立（lì）了13个基因-5hmC标志物（wù）组合检测（cè），可以进一步区分T2D合并单一并发症和（hé）多种并发症[实验组：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明显优于其他（tā）传统临床变量。该研究得（dé）出结论，5hmC标志物（wù）反映了T2D病人大血管/微血（xuè）管（guǎn）并发（fā）症（zhèng）发生过程中的表观（guān）遗传变（biàn）化，因（yīn）而5hmC-Seal检测技术在监（jiān）测糖尿病血管并发（fā）症发生和进（jìn）展（zhǎn）方面具有良好（hǎo）的临（lín）床应（yīng）用前景。

本研究（jiū）共纳入62例2型（xíng）糖尿（niào）病病人，包括没有血管并发症的病人（rén）12例，有（yǒu）单一血管并（bìng）发症的病（bìng）人34例（24例发生大血（xuè）管事件，10例（lì）发生微血管事件），以及有多种（zhǒng）血（xuè）管并发症的病人16例。试（shì）验收集62例病人血浆，提取（qǔ）cfDNA，利用5hmC-Seal技术捕获外周血cfDNA中的5hmC序列，进行二代测序，通过生物（wù）信息学分析找出并发症组与无并发症组之间有（yǒu）显著5hmC修（xiū）饰差异的基因，单一并发（fā）症（zhèng）组和（hé）多种并发症组之（zhī）间有显著5hmC修饰差异的基（jī）因。随后利用（yòng）回归模（mó）型对差异基因进一步（bù）筛选、优化，弹性（xìng）网络（luò）进一步（bù）筛选，计算加权平均分，最后得（dé）到一组具（jù）有高度灵敏度和（hé）特异性的5hmC生物标记物，并进一步在实（shí）验组（zǔ）中验证，分析其灵敏度和（hé）特异性。并将新建（jiàn）立的5hmC标志（zhì）物基因组合（hé）的检测性能与传统临床变量（liàng）进行对（duì）比分析。最（zuì）后对相关基因进行了信号通（tōng）路分析和功能探究。

5hmC修饰水平与血管并发症（zhèng）具有相关性

利用（yòng）逻辑（jí）回归模型对62例有并发症和无并发症2型糖尿病（bìng）病人（rén）的5hmC差异水（shuǐ）平进（jìn）行分析发现，有（yǒu）并发（fā）症2型糖尿病病（bìng）人的622个差异修饰候选基因（包括上调和下调（diào）基（jī）因）的归一（yī）化平均数要明显高于无（wú）并发症的（de）病人（P<0.001），但（dàn）是单一并发症和多（duō）发并发症（zhèng）病人之间没有显著差异。

之（zhī）后将（jiāng）有单一并发（fā）症或多种并发（fā）症（zhèng）的50例病人（rén）用逻辑（jí）回归模型进行了对比（bǐ），发现多种并发症的（de）病（bìng）人的153个差（chà）异修饰候选基因（包（bāo）括上调和下调基因）的归一（yī）化平均数要低（dī）于无并发症病人（P<0.001）。

5hmC标志物可区（qū）分有（yǒu）无并发（fā）症患者

62例2型糖（táng）尿（niào）病病人（rén）被（bèi）随机分成训练组（n=31）和（hé）测（cè）试组（n=31）。利（lì）用弹性（xìng）网络筛选后发现，16基因（yīn）-5hmC标志（zhì）物组合检测可以用（yòng）于区分有并发症和无并发症的2型糖尿病（bìng）病（bìng）人。

基于16基因组合模型 (Detection Model 1) 的（de）加（jiā）权平均分分析（xī），发现无并发（fā）症病人（rén）的分数在训练集（jí）和测试集中（zhōng）都明显低于有（yǒu）并发症的病人。只考虑加权平均（jun1）分的话，受试（shì）者（zhě）工作特征曲线（ROC）分（fèn）析表明将cutoff值设置成0.5时，在测试（shì）组中中的灵敏度（dù）为60%，特异性为100%。

5hmC标志物可区（qū）分病人是单（dān）一并（bìng）发症还（hái）是（shì）多种并发症

50例有并发症的2型（xíng）糖（táng）尿病（bìng）病（bìng）人被随机分成训练组（n=25）和测（cè）试（shì）组（n=25）。利用弹性网络筛选后发（fā）现，13基因-5hmC标（biāo）志物组合可以区分2型糖尿病（bìng）病人是否发生单一（yī）并（bìng）发症或（huò）多种并（bìng）发症。

基于13基因组合模型 (Detection Model 2)， 我们计算了单一并发（fā）症（zhèng）和多种（zhǒng）并发症（zhèng）的加权平均分，发现在训练集（jí）和（hé）测（cè）试（shì）集中单一并发症和多种并发症病人的分数都有明显差异。值得一提的（de）是，有肾病并发症和无（wú）肾病并发症病人的分数也有明（míng）显差异。利用加权平均分作（zuò）为判（pàn）断标（biāo）准的受试者工作特（tè）征曲线（ROC）表明，在测试（shì）组中当将cutoff值设成（chéng）0.69时，灵（líng）敏度为87.5%，特异性为68.8%。

5hmC标志物（wù）与传统临床变量/危险（xiǎn）因子的对（duì）比

我（wǒ）们（men）评估了不同临床变量/危险因子用于监测血（xuè）管并发症（zhèng）的灵敏度和（hé）特异性（见表1）。

信号通路分析和功能（néng）探（tàn）究

有并发症和无并发症病人的135个差异候（hòu）选基因的功能注释（shì）分析表明（míng），这些基（jī）因主要（yào）富集在一些经典的信号通路。错误发现率相关P值位于前10%和基因数目≥3的信号通路包括（kuò）由IGF1R, IL-10和FGFR2所介导的信号通路（lù）。由IGF1R和IL-10介导的信（xìn）号通路与胰（yí）岛素抵抗及炎（yán）症（zhèng）反应（yīng）相关，在血管（guǎn）生（shēng）物学和糖尿病发生发展过程中发（fā）挥（huī）重要作用。

Reactome相（xiàng）互作用网络（luò）的（de）中心表明，泛素编码基因[泛素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛（fàn）素A-52亚基核糖体（tǐ）蛋白融（róng）合产物1(UBA52)]是候选基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重要连接者（zhě）。在这135个差异候选基因中, 一些基因（yīn） （如（rú）TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现出与糖尿（niào）病病程相关（guān）的倾（qīng）向，表明5hmC和糖尿病血管并发症之间可（kě）能存（cún）在时间依赖（lài）性的相互作用。基于（yú）纵（zòng）向时间（jiān）队（duì）列的大样本研究，将可（kě）进一（yī）步明确5hmC变化（huà）和糖尿病持续时间之间的动态关联。关于（yú）单一并发（fā）症和（hé）多种并发症病（bìng）人的159个候（hòu）选（xuǎn）标志基因的功能注释研究发现，存在细胞-细（xì）胞连接、胶原蛋白（bái）形成、新陈代谢、细（xì）胞应激应（yīng）答信号通路的（de）富集，这（zhè）些（xiē）信号通路（lù）均与细胞基本（běn）功（gōng）能密切相关。

血管并发症是三分（fèn）之二糖尿（niào）病病（bìng）人的死亡原（yuán）因，若能及早有效控制血管并发症（zhèng）的发生，将极大地改善糖尿（niào）病病人的生（shēng）存质量。该研究建立了一（yī）种利用cfDNA进行2型糖尿病血（xuè）管并（bìng）发症监（jiān）测的无（wú）创便捷方法，较目（mù）前临床标志物（wù）能更准确（què）地监（jiān）控血管并（bìng）发症的（de）发（fā）生，从而提示临床（chuáng）及早采（cǎi）取（qǔ）应对（duì）措施（shī），有效控制病情进展。